Metodo in microscala per la determinazione del profilo di temperatura di attività enzimatiche: il caso dell’attività xilanasica fungina
Questo lavoro ha riguardato lo sviluppo di un metodo rapido
in microscala per la determinazione del profilo di attività
enzimatica in funzione della temperatura di numerosi
campioni in parallelo. Il metodo si basa sull’utilizzo di un
termociclatore per PCR capace di produrre un gradiente
di temperatura in una piastra a 96 pozzetti per testare contemporaneamente
fino ad 8 campioni per 12 diverse temperature.
Il metodo è stato messo a punto saggiando in micropiastre
l’attività xilanasica di funghi filamentosi provenienti
dal deserto freddo di Atacama, Cile, in confronto a
xilanasi commerciali da funghi mesofili e da microrganismi
termofili.
Il metodo proposto consente la riduzione dei tempi di
screening. La maggior parte degli estratti enzimatici ha mostrato
ottimi di temperatura intorno a 42 °C, inferiori di 10-
35 °C rispetto agli enzimi commerciali da funghi mesofili/
termofili. Sono stati inoltre osservati 3 estratti che mantenevano
il 30% di attività a 22 °C, mentre per la maggioranza
degli estratti è stata rilevata un’attività inferiore al 3% alla
temperatura di 63 °C.
Il metodo può essere facilmente adattato per determinare
stabilità e profilo di temperatura di diverse attività enzimatiche
fungine. I principali vantaggi consistono nell’ottimo
controllo della temperatura e nella possibilità di effettuare
fino a 8 profili in parallelo.
A micro-scale high-throughput method for the determination of temperature profile of enzymatic activities: the case of the fungal xylanase
The aim of this study was the development of a microscale rapid method for the determination of temperature profile of enzymatic activity of several samples at the same time. This method utilizes a temperature-gradient PCR cycler able to create a temperature gradient in a 96-well plate to assay up to 8 samples at 12 different temperatures. The method has been developed assaying in microplates the xylanase activity of a collection of filamentous fungi isolated from soil samples of the cold Atacama desert, Chile, in comparison with commercial xilanases from mesophilic/ thermophilic microorganisms. The proposed method allows fast screening procedures. Most of the enzymatic extracts showed an optimum temperature of xylanase activity of 42 °C, less than 10-35 °C with respect to commercial enzymes obtained by mesophilic/ thermophilic microorganisms. Three extracts still maintaining 30% of activity at 22 °C were also observed, while most of the extracts showed less than 3% of activity at 63 °C. This method can be easily adapted to determine the stability and the temperature profile of different fungal enzymatic activities. The key advantages consist of a precise control of temperature and of the possibility to obtain up to 8 profiles in parallel.
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